敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)-RNAi技术-试剂-生物在线
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敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)

敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)

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产品名称: 敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)

英文名称: 敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)

产品编号: HZ1520

产品价格: 0

产品产地: 中国/上海

品牌商标: 沪震生物

更新时间: 2023-08-17T10:24:20

使用范围: null

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 敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)

中文名称:敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ(POD)
英文名称:
产品规格:100T
保存:置4℃。
工作量:100张切片。
有效期:一年。
所谓原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法,在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生,发展和调控等根本性问题的有力工具,其作用是免疫组化所无法代替的。具有敏感性特高,操作简便和结果准确的优点。该试剂盒分为两种,一种为过氧化物酶检测,一种为碱性磷酸酶检测系统。用于mRNA的杂交。仅适于地高辛高效标记的寡核苷酸探针,不推荐使用每个探针分子仅标记一个地高辛的寡核苷酸探针。
如果使用 cDNA 探针,应在杂交之前变性探针。
试剂盒中内容:
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml;
2.预杂交液 2ml;
3.寡核苷酸探针杂交稀释液 2ml;
4.封闭液 5ml;
5.生物素化鼠抗地高辛 5ml;
6.SABC-POD 5ml;
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂:
原位杂交专用盖玻片;POLY-L-LYSINE;DEPC;20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC,0.5×SSC,0.2×SSC,0.5M PBS)
一.培养细胞和冰冻切片
准备工作:缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml 蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,PH2.0 左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g,柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O,分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。
0.5 M PBS ——1000ml蒸馏水加氯化钠 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O
0.4g,PH7.2-7.6。
操作程序:
注意:最重要的是及时固定,并在固定液中加入 0.1%的DEPC 处理,以抑制 RNA酶对 mRNA的分解作用.
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度 10-20μM。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和 5%的CO2,所用培养基为Dulbecco 基础培养基。细胞长好后 0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS,含有 1/1000 DEPC。室温固 定 20--30分钟。蒸馏水洗,干燥后可-20℃冰冻保存 2 周。
4.30%H2O2 一份+甲醇 50 份混合,室温处理 30分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤 3次。
5.暴露 mRNA 核酸片段:切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加 2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化 5—120 秒钟。有时也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度。按每张切片 20μl加预杂交液。恒温箱 37-40℃2—4 小时。吸取多余液体,不洗。
7.杂交——用杂交稀释液 稀释地高辛标记的寡核苷酸探针,浓度一般 0.5-2μg/ml。按每张切片加 20μ ι 杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后,盖在切片上。恒温箱 37—40℃杂交过夜。
8.杂交后洗涤:去掉盖玻片,30—37℃左右水温的2×SSC洗涤 5分钟×2次;0.5×SSC洗涤 15分钟×1次;0.2×SSC洗涤 15分钟×1次。必要时可重复 0.2×SSC洗涤 1次。
9.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
10.滴加生物素化鼠抗地高辛:37℃60或室温 120分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
11.滴加 SABC:37℃20分钟或室温 30分钟。0.5M PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温 30分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。
13.DAB 显色:使用 DAB 显色试剂盒—1ml 蒸馏水加显色剂A,B,C 各一滴,混匀,加至标本上。镜下控制显色,一般在 30分钟内。若无背景出现则可继续显色。也可自配 DAB显色剂后显色。充分水洗。
14.必要时苏木素复染,充分水洗。
15.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
二.石蜡切片
如果有条件的话,应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后,及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 MPBS,含有 1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过 4mm的小块,固定 1 小时即可,较大的标本固定不要超过 2 小时。某些组织对过度固定尤其敏感,如动物大脑,固定时间 30-40分钟,一定不要超过 1 小时。
1.常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度 6-8μM。
2.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。
3.石蜡切片经常规脱蜡至水。3%H2O2 室温处理 10分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤 2次。
4.暴露 mRNA 核酸片段:切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加 2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化 3--30分钟(视标本厚薄、新旧自行调整)。充分的消化可以使 mRNA 得到暴露,从而增强杂交信号;但另一方面,过度的消化又使切片明显减薄乃至消失,从而失去杂交信号。由于用户的切片情况各不相同,这就需要用户比较不同的消化时间,例如 10分钟,20分钟,30分钟,以找到最佳的消化时间。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
其余步骤和冰冻切片 6-15 步相同。
结果观察:
阳性细胞的胞浆着色呈棕黄色。
注意事项:
如果有少量的细胞核着色属于正常情况;如果出现大量的细胞核着色,往往和标本固定时间过长有关,应重新处理标本。有其它明显的非特异性染色现象时,可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释,一般稀释 2—5倍。 

特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!