在植物研究中，蛋白互作的验证是解析信号通路和功能机制的关键环节。共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）是研究蛋白-蛋白相互作用的经典技术，常用于验证候选蛋白之间的物理结合。尽管Co-IP在哺乳动物细胞中应用广泛，但在植物组织中开展Co-IP实验则面临一系列特有挑战，包括细胞壁的存在、蛋白表达量低、次生代谢物干扰等。本文将系统介绍如何从植物样品中开展高质量的Co-IP实验，并提出优化策略，助力植物蛋白互作研究。

一、Co-IP技术简介

Co-IP是一种基于抗原-抗体特异性结合的免疫亲和纯化方法，用于从细胞裂解液中共沉淀目标蛋白及其互作伴侣。简要流程包括：

• 提取蛋白总裂解液
• 使用特异性抗体与目标蛋白结合
• 利用蛋白A/G磁珠或琼脂糖珠捕获抗原-抗体复合物
• 洗脱并进行SDS-PAGE及Western blot检测

在植物样品中，尽管原理不变，但实验设计和样品处理策略需特别优化以应对植物组织的独特生物化学特性。

二、植物组织开展Co-IP的核心难点

1、细胞壁影响蛋白提取效率

植物组织细胞壁富含纤维素和多糖，限制了蛋白质的高效提取。

2、次生代谢产物干扰

酚类、鞣酸、多糖等物质易与蛋白质结合，影响抗体结合和下游检测。

3、蛋白表达量低

内源蛋白通常表达量有限，容易因降解或提取效率低而造成假阴性。

4、非特异性结合问题

植物组织中背景蛋白多，非特异结合可能导致高背景和假阳性结果。

三、Co-IP实验流程与关键优化策略

1、样品准备：选材与处理

（1）样本来源：

常用材料包括烟草瞬时表达系统（如Nicotiana benthamiana）、拟南芥、玉米、水稻等。建议优先选择表达量较高的瞬时表达系统，有助于提高检测灵敏度。

（2）预处理建议：

• 使用液氮快速冷冻并充分研磨组织，确保细胞破碎充分。
• 加入蛋白酶抑制剂混合物，避免蛋白降解。
• 对富含酚类的组织（如根、种子）可添加PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）以吸附多酚。

2、蛋白质提取：优化裂解液配方

（1）推荐裂解液组分：

• 缓冲液（如Tris-HCl或HEPES，pH 7.4–8.0）
• 盐（NaCl或KCl，维持蛋白稳定性）
• 去污剂（非离子型，如NP-40或Triton X-100，避免SDS）
• 甘油（增强蛋白稳定性）
• EDTA（螯合金属离子，抑制蛋白酶）
• 蛋白酶/磷酸酶抑制剂

（2）注意：

根据目的蛋白的性质调整盐浓度和去污剂种类。可预先进行蛋白稳定性梯度试验，确定最佳提取条件。

3、抗体与标签选择：决定互作检测灵敏度

（1）对于内源蛋白：需高亲和力、高特异性的商业或自制抗体。

（2）对于外源蛋白表达系统：常用标签包括FLAG、HA、MYC、GFP等。

（3）抗体耦联方式：优选抗体预结合蛋白A/G磁珠（magnetic beads）以简化流程。使用covalent crosslink策略可避免IgG重链干扰下游WB检测。

4、免疫沉淀步骤：关键操作细节

• 预先清洗磁珠以降低非特异结合。
• 蛋白裂解液与抗体/磁珠孵育时间建议控制在2–4小时（4°C缓慢旋转）。
• 使用多次高盐洗涤（如250–300 mM NaCl）清除非特异结合蛋白。
• 温和洗脱（如低pH缓冲液或竞争性抗原肽）可保持蛋白活性和构象。

5、检测分析：Western Blot验证互作

• 采用高灵敏度的ECL底物检测信号。
• 输入组（Input）和阴性对照（如无标签或空载）是必不可少的。
• 建议验证多个互作位点或标签方向（正向/反向Co-IP）以增加可信度。

四、拓展应用：与质谱联用进行蛋白互作组学研究

对于未知互作蛋白筛选，Co-IP结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是强有力的策略：

• 可从植物组织中富集目标蛋白复合体
• 脱盐酶解后进行质谱分析，识别互作伴侣蛋白
• 与标签蛋白Pull-down或BioID等方法互补

在植物研究中，Co-IP实验作为验证蛋白互作的重要手段，具有不可替代的科学价值。尽管植物组织存在诸多实验挑战，但通过合理的优化策略与技术平台支持，依然可以获得可靠的互作数据。随着植物分子生物学研究的不断深入，结合高分辨率质谱技术的Co-IP已成为解析复杂信号网络的有力工具。百泰派克生物科技凭借专业的实验体系和丰富的服务经验，能够为植物科研工作者提供高效、准确的蛋白互作研究解决方案，助力探索植物生命过程中的关键分子机制。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

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北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

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