蛋白磷酸化是细胞信号传导、代谢调控和基因表达调控等多种生物学过程中的核心机制之一。其通过将磷酸基团共价地附着于特定氨基酸（Ser/Thr/Tyr）上，迅速改变蛋白结构、活性、定位或互作伙伴，从而实现功能切换。定量磷酸化组学正是基于高通量质谱技术，系统测量各磷酸化位点在不同条件下的强度变化，追踪信号传导路径，并构建蛋白功能调控网络。从磷酸化定量出发，解读蛋白功能调控网络，本文将从科普角度出发，详解其实验策略、数据分析流程与生物意义洞察。

一、技术路线：磷酸化定量的三大支柱

1、样品制备：蛋白提取与磷蛋白富集

（1）高效提取：使用裂解缓冲液（SDS/尿素等）结合酶抑制剂，最大限度保留磷酸化状态。

（2）酶解策略：胰蛋白酶 (trypsin) 消化生成脂肽；为增强 Tyr 催化位点检测，又常结合 Asp-N、Glu-C 酶酶切。

（3）富集方法：金属氧化物亲和色谱（MOAC，如TiO₂、ZrO₂）或金属螯合亲和（IMAC，如Fe³⁺-NTA）选择磷肽。有经验团队通常协同使用两种策略以提升磷肽覆盖度。

2、定量标记与质谱检测

（1）同位素标记技术：

① TMT（Tandem Mass Tag）支持多达 16-plex，适合复杂实验设计；

② SILAC（Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture）应用于细胞模型；

③ Label-free 定量适合样本量大、预算有限的情况。

（2）高分辨质谱平台：

目前主流有 Orbitrap Fusion Lumos、Q Exactive HF-X 等，具备高质量分辨率、快速扫描与高通量吞吐能力。

3、数据处理与统计分析

（1）定性–定量识别：使用软件如 MaxQuant、Proteome Discoverer、Spectronaut 等，识别磷肽并计算 TMT 强度或 LFQ 值，并进行归一化。

（2）显著差异提取：应用 Student’s t 测试、ANOVA 及多重校正（FDR）筛选差异磷酸化位点。

（3）生物富集分析：引入 GO/KEGG/Reactome 路径富集、基序分析（Kinase motif）、蛋白–蛋白互作（PPI）网络构建。

（4）调控网络预测：基于磷酶/激酶数据库（PhosphoSitePlus, KinomeXplorer）预测上下游关系，并结合网络拓扑学底层算法识别核心节点。

二、生物学洞察：从位点到系统

1、激酶–底物网络重构

磷酸化定量分析有助于重构激酶–底物关系。举例：在细胞应激或药物处理条件下，比较处理组与对照组的磷化变化：

（1）CK2、CDK、MAPK 等常见激酶的底物位点富集，揭示信号通路活性提升；

（2）Motif-X 分析帮助识别新型激酶上游激活信号；

2、动态调控网络：时间与条件依赖性

（1）多时间点或多条件设计方案，有助于解析信号传播顺序：

① 簇分析（K‑means / hierarchical）聚类位点变化趋势；

② 轨迹分析：构建时序路径图谱，识别先驱节点；

3、多组学整合：连接磷酸化与代谢／蛋白表达网络

（1）将磷酸化组学与蛋白组学、代谢组学结合：

① 联合聚类分析定位信号级联对代谢路径的整合调控；

② 相关网络模型揭示“磷酸化—酶活性—代谢产物”三位一体机制；

三、应用前沿：机制研究与临床转化

1、新机制发现

磷化位点定量技术已用于揭示多种疾病的新调控机制：

（1）癌症信号通路异常；

（2）神经退行性疾病中突触蛋白磷化动态；

（3）免疫细胞激活/抑制过程中的信号传导。

例如在 mTOR/Akt 通路研究中，通过磷化定量确定关键调控节点，实现针对性药物作用点验证。

2、药物靶标及耐药机制研究

（1）可用于筛选药物诱导的磷化改变位点；

（2）识别耐药相关激酶的激活/抑制状态；

3、生物标志物与临床诊断

（1）药物反应中磷蛋白变化可作为临床监测指标；

（2）针对不同病理条件（如代谢紊乱、慢性炎症），发展磷化质谱检测平台；

四、未来趋势：AI + 磷化组学融合

1、深度学习增强识别：利用 AI 模型预测未知磷化位点；

2、自动化样本处理与质谱解析管线：提升处理效率与数据一致性；

3、云平台数据整合：集成公共资源（如 PhosphoSitePlus、PTMcode）进行在线对比分析；

六、总结与展望

磷酸化定量研究不仅描绘蛋白功能图谱，更推动了信号机制与临床靶点研究的转化。百泰派克生物科技依托先进的 Orbitrap/Lumos 平台、自主 AI 数据pipeline 和一站式生物信息分析，为科研机构与企业提供高质量、高通量的磷化分析服务，助力客户深入洞察生物机制、加速成果产出。目前，百泰派克生物科技已构建高通量自动化磷化检测平台，并开发 AI 辅助数据处理系统，进一步提高分析速度与复现性。同时推出“双重磷化标志物检测套件”，为医学研究领域提供高灵敏且定量精准的检测方案，为客户提供完整机制解读及图谱可视化报告，提升项目价值与发表潜力。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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