蛋白质乙酰化主要发生在赖氨酸残基（K）上，是一类重要的翻译后修饰。由于其修饰位点低丰度、信号弱且背景复杂，在进行LC-MS/MS质谱分析前，必须采用特异性富集策略以提取目标肽段，提高检测灵敏度。在质谱分析前对乙酰化肽段（acetylated peptides）富集，是研究蛋白乙酰化修饰（acetylation）必不可少的步骤。由于乙酰化修饰在复杂生物样本中通常含量低、丰度差异大，若不经过富集，质谱可能无法有效检测出这些关键修饰位点。本文将从原理、主流方法、技术挑战及优化策略四个方面，系统介绍如何高效富集乙酰化肽段。

一、乙酰化肽段富集原因

1、乙酰化修饰的特征

蛋白质乙酰化多发生于核蛋白和酶类，调节其活性、稳定性或细胞定位。与磷酸化相比，乙酰化位点更分散、低丰度，且缺乏统一的二级结构偏好。

2、质谱识别难点

在未经富集的条件下，乙酰化肽段常常被更高丰度的非修饰肽所掩盖，造成质谱信号无法准确识别乙酰化位点。

3、富集的重要性

只有通过选择性地富集乙酰化肽段，才能在高通量质谱平台上实现足够的检测深度，进而获得可信赖的修饰图谱。

二、乙酰化肽段富集的主流方法

1、抗体亲和富集

（1）原理

使用针对乙酰化赖氨酸（Ac-Lys）的单克隆抗体，通过免疫沉淀的方式选择性捕获乙酰化肽段。

（2）流程简述

① 蛋白酶（如Trypsin）消化蛋白

② 肽段孵育于包被抗体的磁珠或树脂上

③ 洗脱乙酰化肽段

④ LC-MS/MS 分析

（3）优缺点

优点：

① 高专一性，适用于复杂样本（组织、细胞系）

② 可用于不同类型样本的通用平台

缺点：

① 成本较高

② 抗体批间差异影响重复性

③ 某些低亲和力的乙酰化位点可能富集效率低

2、化学衍生结合策略

（1）原理

将乙酰化赖氨酸位点进行化学衍生，使其具有可被亲和基团识别的标签（如biotin），进而通过链霉亲和素（streptavidin）富集。

（2）流程简述

① 化学衍生（如hydrazide reaction）

② 与亲和载体结合

③ 洗脱富集肽段

④ LC-MS/MS 分析

（3）优缺点

优点：

① 可提高某些低丰度位点的检测概率

② 方法可控性强，适用于定量研究

缺点：

① 实验步骤复杂，易造成样本损失

② 对化学反应条件敏感，需严格优化

3、质谱标签结合富集

在定量蛋白乙酰化组学研究中，常结合TMT/iTRAQ等同位素标记手段，先标记肽段后再进行抗体富集，实现多样本并行比较。

三、乙酰化肽富集效果的评估指标

一个有效的乙酰化富集流程，需关注以下几个核心指标：

1、特异性：乙酰化肽段在总肽段中的比例，通常要求 > 80%

2、重复性：多个样本/技术重复中富集位点的一致性

3、覆盖度：可检测乙酰化位点的数量及其分布范围

4、背景干扰：非特异性结合的非乙酰化肽段比例

四、提升乙酰化富集效率的优化策略

1、样本量与酶解效率

（1）富集前推荐使用 ≥1 mg 蛋白输入

（2）酶解效率直接影响肽段数量与多肽完整性

2、缓冲体系优化

（1）高盐或pH偏移会影响抗体结合效率

（2）富集缓冲液中可加入0.1% NP-40以减少背景

3、洗脱与洗涤

（1）梯度洗脱或低pH可提高乙酰肽回收率

（2）合理设置洗涤次数可降低非特异性结合

4、高分辨质谱平台的联合使用

采用如Orbitrap Fusion Lumos、Exploris等高端质谱平台有助于提高位点深度与定量准确性

五、蛋白乙酰化研究的应用场景

1、肿瘤标志物筛选：发现与癌症发生发展相关的关键乙酰化位点

2、代谢调控机制研究：解析乙酰化在代谢酶活性调节中的作用机制

3、药物作用机制解析：例如HDAC抑制剂对细胞中乙酰化水平的影响

4、蛋白互作网络调控：探索乙酰化修饰对PPI网络的影响与调控机制

蛋白质乙酰化是一种广泛存在于真核细胞中的翻译后修饰，尤其是赖氨酸残基上的ε-N-乙酰化（Lysine acetylation），被认为在调控转录、代谢、DNA修复、信号传导等过程中发挥关键作用。由于乙酰化肽段在复杂蛋白质组中丰度较低、信号弱，因此在质谱分析前进行有效的富集处理，是开展乙酰化修饰组学研究的关键前提。百泰派克提供一站式乙酰化质谱服务优势：提供从样本制备、乙酰化富集、质谱分析到生物信息学解读的完整服务流程，包括：高亲和抗体富集体系；Orbitrap高分辨率质谱平台；支持TMT/iTRAQ等定量实验设计；个性化乙酰化通路富集分析；中英文结果报告+生信图表可视化。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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