泛素化（ubiquitination）是细胞调控中的关键蛋白修饰方式，涵盖蛋白质降解、信号转导、细胞周期和DNA 损伤响应等多种重要生理过程。然而，如何在复杂体系中精确、灵敏地定量泛素化蛋白质，仍然挑战巨大。使用 LC‑MS/MS（液相串联质谱）进行泛素化蛋白质定量，已成为研究该类修饰的关键技术手段。通过高分辨率质谱检测特异性修饰肽段，配合 TMT 多重标记策略和智能数据分析流程，科学家们可以系统性揭示泛素链类型、定位修饰位点，并定量比较不同处理条件下的变化，为泛素调控机制研究提供有力支撑。

一、LC‑MS/MS 进行泛素化蛋白质定量优势

1、高灵敏度与特异性

LC‑MS/MS 能在低至 amol–fmol 级别检测并定量带有泛素或异构泛素链的肽段，尤其借助高分辨质谱（如 Orbitrap 及 Q‑Exactive），可实现 <1 ppm 质量精度，保证泛素化位点鉴定的可靠性。

2、高通量定量能力

质谱底层支持 TMT（Tandem Mass Tags）或 SILAC（Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture）等多重定量策略，可在一次实验中完成多达 10–16 个样品的并行分析，大幅提升研究效率。

3、定性与定位双重保障

MS/MS 级质谱使得特定泛素化残基（如 Lys48、Lys63）的精确定位成为可能，并结合光谱和肽段特异性，有效避开重叠峰和背景干扰，确保结果可信度高。

二、实验流程 Overview of Experimental Workflow

以下以典型的 TMT 标记策略为例，阐述 LC‑MS/MS 在泛素化定量研究中的标准实验流程。

1、蛋白提取与预处理

（1）样本类型：细胞、组织或体液，可根据研究目的选择合适方案；

（2）裂解缓冲液：使用含 1% NP‑40 或 SDS 的缓冲液，配合蛋白酶抑制剂（如 PMSF、leupeptin）、泛素链保护剂（如 N‑ethylmaleimide）来维持泛素化状态；

（3）浓度测定：BCA 或 Bradford 法测定蛋白浓度，确保下游定量准确性。

2、泛素化肽段富集

（1）使用链特异性抗体（如抗-K-ε-GG）结合磁珠富集泛素化肽段；

（2）优化洗脱条件（pH、盐浓度）保留修饰肽同时去除非特异背景。

3、蛋白质酶解 & TMT 标记

（1）蛋白酶解：加入胰蛋白酶（Trypsin）在 37 °C 消化 4–16 小时；

（2）TMT 标记：消化后使用 TMT10/16plex 试剂，按通量要求设置对照 vs 处理组；

（3）标记后合并样本，减少批次效应。

4、多维色谱分离

（1）高 pH RPLC 或 HILIC 预分离提升复杂性；

（2）低 pH nano‑LC 上样至 MS 进行高灵敏质谱分析。

5、LC‑MS/MS 分析

（1）采用 Thermo Fisher Orbitrap Fusion 或 Q Exactive 系列；

（2）建议设置 DDA（数据依赖采集）模式，MS1 分辨率 ≥ 120,000；MS2 分辨率 ≥ 30,000，collision energy 优化为 HCD 30‑35%；

（3）Top‑10 或 Top‑20 多肽 MS2 采集方式，提高泛素肽捕获概率。

6、数据处理与定量分析

（1）使用 Proteome Discoverer、MaxQuant、Spectronaut 等软件；

（2）鉴定泛素化位点（Gly‑Gly 修饰，+114.0429 Da）并筛选 FDR ≤ 1%；

（3）定量 TMT 信号做归一化、批次校正；

（4）结合生信工具（如 Perseus、Cytoscape）进行功能富集和网络分析。

三、泛素化蛋白质定量关键技术挑战及应对策略

1、泛素化肽丰度低

（1）挑战：修饰仅占极小比例，易被非修饰背景淹没；

（2）策略：多次富集（2–3 轮）+多维预分离提高修饰肽相对含量；增加数据采集深度。

2、泛素链类型复杂

（1）挑战：不同链类型（K48, K63, M1 等）修饰功能不同但难区分；

（2）策略：可采用链特异性抗体或 UB-AQUA 标准肽定量策略明确链型组成。

3、数据重复性与定量偏差

（1）挑战：质谱检测中技术波动及样本间差异易导致数据重复性不足；

（2）策略：使用内部或外部标准（如 PRTC 肽段、iRT 肽段）校正实验偏差；针对 Ratio-Compression 问题，可通过提高 MS2 分辨率及优化 RI（Reporter Ion）通道设计加以缓解。

四、泛素化蛋白质定量实验设计建议与注意事项

1、样本批次控制：联合 TMT 通道设计对照 + 实验组样本；

2、重复策略：每个 TMT 实验应至少三份技术重复，并辅以 ≥ 3 份生物重复，提高统计功效；

3、软件与统计方法选择：Proteome Discoverer + Percolator/FDR 控制建议；

4、泛素链识别控制：选择抗体前需验证亲和性与特异性，建议购自经过验证的商业供应商。

LC‑MS/MS 技术在泛素化蛋白质定量中的应用已深入科研前沿。通过 TMT 标记、泛素肽富集、多维色谱与高分辨 MS/MS 相结合，可以在系统水平上揭示复杂泛素调控机制。百泰派克生物科技融合自主优化的 LC‑MS/MS 技术平台与专业服务团队，助力科研机构和企业实现高质量泛素定量分析，推进靶点发现、药物研发与机制研究。若您正在设计泛素化研究方案或对泛素定量数据结果深度剖析有需求，欢迎联系百泰派克生物科技，我们可提供从实验设计到生信分析的一站式支持。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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