凋亡，也称为程序性细胞死亡，是一种由特定基因调控的有序或程序化的细胞死亡过程。它是细胞的一种主动死亡过程，也是细胞的正常生理反应。凋亡细胞最终会被体内的吞噬细胞处理。过度凋亡会直接导致组织和器官功能的下降；而对于癌细胞而言，凋亡过程的中断则意味着癌症的发展和扩散。

细胞形态变化

细胞凋亡的形态变化通常可以分为三个阶段。第一阶段涉及细胞间接触的消失，但细胞膜仍然完整。核糖体从粗面内质网脱落，细胞核出现凝聚的迹象。这个阶段持续时间非常短暂。第二阶段涉及细胞核的碎裂，碎裂的细胞核与细胞内的各种细胞器结合，并被细胞膜进一步包裹形成凋亡小体。第三阶段涉及吞噬细胞吞噬凋亡小体并将其消化，以便被生物体重新利用。

细胞凋亡的机制

(1) 死亡受体途径及其调控：Fas/Fas配体（FasL）死亡途径；肿瘤坏死因子受体（TNFR）死亡途径。

(2) 线粒体途径及其调控。

(3) 内质网途径：CHOP途径；c-Jun N端激酶（JNK）途径；Caspase 12途径。

(4) 细胞凋亡的端粒酶途径。

(5) 一氧化氮（NO）参与的细胞凋亡反应。

检测细胞凋亡的常见方法包括以下

1. 形态学检测
正在经历凋亡的细胞会表现出特定的形态学特征。最常用的形态学检测方法包括荧光共聚焦激光扫描显微镜和透射电子显微镜。前者允许特定的染料（如Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI）对细胞进行染色。这些染料在紫外线激发下，通过非插入式结合到DNA的A-T碱基区域，发出明亮的蓝色荧光。

凋亡HeLa细胞DAPI染色中核染色体形态的变化

在凋亡过程中，HeLa细胞的细胞核会发生形态变化。与此同时，凋亡细胞体积缩小，细胞质变得更加浓缩。在凋亡的早期阶段（前凋亡核），细胞核内的染色体高度凝聚，并呈现出许多类似空泡的结构，称为空泡化。在中期阶段（Ⅱa期），细胞核内的染色体高度凝聚并边缘化。在凋亡的晚期，细胞核碎裂成较小的片段，形成凋亡小体。在电子显微镜下，凋亡细胞显示出体积减小，表面微绒毛消失，细胞质浓缩。

电子显微镜下凋亡Jurkat细胞核染色体的形态变化

2. 检测早期凋亡最常用的方法是Annexin V/PI双染实验。
在正常细胞膜中，磷脂的分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜的内侧。在细胞凋亡过程中，细胞膜发生变化，导致PS从内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin V是一种依赖于钙的磷脂结合蛋白，对PS具有很强的亲和力。Annexin V能够特异性识别凋亡细胞表面的PS，因为活细胞中的PS位于细胞膜的内侧，不能特异性结合Annexin V。因此，可以使用FITC标记的Annexin V来区分凋亡细胞和活细胞。

坏死细胞的PS也会从内侧翻转到细胞膜的外侧，Annexin V也能识别坏死细胞表面的PS。因此，Annexin V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。然而，碘化丙啶（PI）染料可以结合细胞内的DNA，区分坏死细胞和活细胞。在早期凋亡细胞和活细胞中，细胞膜保持完整，阻止PI染料自由通过细胞膜结合到细胞内的DNA。因此，PI染料不能标记凋亡细胞和活细胞。PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜并结合到细胞内的DNA。当坏死细胞内的PI染料被488nm激光激发时，会发出红色荧光，由相应的通道检测。因此，通过同时使用Annexin V和PI，可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

3. 细胞凋亡 - 线粒体膜电位的检测

JC-1是一种亲脂性阳离子荧光染料，能够与线粒体基质结合。其荧光强度的增强或减弱表明线粒体膜的电子亲和力增加或减少。在正常的生理条件下，线粒体带有高度的负电荷，JC-1以聚集体的形式进入线粒体，强烈地发出红色荧光。在细胞凋亡过程中，线粒体发生去极化，导致负电荷减少。因此，JC-1在细胞质中以单体形式存在，导致绿色荧光增强

4. 细胞凋亡 - 活化Caspase-3的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡过程中发挥着至关重要的作用，其中Caspase-3是一个关键的执行分子，它在许多凋亡信号传导途径中起作用。Caspase-3通常以酶原（32 KD）的形式存在于细胞质中。在凋亡的早期阶段，它被激活。活化的Caspase-3由两个大亚基（17 KD）和两个小亚基（12 KD）组成，能够裂解相应的细胞质和核内底物，最终导致细胞凋亡。然而，在凋亡的晚期和死亡细胞中，Caspase-3的活性显著下降。

活化的Caspase-3由其前体裂解形成17KD的亚基和12KD的亚基，形成异二聚体，可以被特异性的抗活化Caspase-3抗体识别。通过使用荧光素标记的抗活化Caspase-3抗体，可以检测活化的Caspase-3。

5. 细胞凋亡 - DNA碎片化的检测

在细胞凋亡过程中，染色质凝聚，染色质内的DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成180~200bp及其倍数的寡核苷酸片段。一旦DNA碎片化发生，在DNA双链结构上就会出现许多缺口。在酶的作用下，FITC标记的dUTP或BrdU可以嵌入到这些缺口中，然后可以检测嵌入信号的强度，以确定碎片化的程度。

6. TUNEL检测方法
此外，检测DNA碎片化的另一种方法是TUNEL（末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记）检测方法。在细胞凋亡过程中，DNA双链或单链的断裂产生大量粘性的3'-OH末端。利用这一线索，在末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）的帮助下，生物素/荧光素标记的dUTP成功地结合到3'-OH末端。通过酶联比色法或荧光检测，可以对结果进行定量分析。

总之，细胞凋亡是由凋亡途径中的各种分子促进的，仅凭单一指标的检测很难轻易确定凋亡的发生。毕竟，在细胞凋亡的事件中，每个指标只维持一定的时间。因此，建议研究人员广撒网，最好在不同的时间点使用多个指标来确认凋亡的发生。最后，为了避免假阳性和假阴性，设置阳性和阴性对照至关重要，以确保检测结果的准确性。

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