D-Lin-MC3-DMA 是一种可电离的阳离子脂质, 是一种有效的递送 siRNA 载体。
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体外研究
MC3脂质纳米颗粒的制备
在这里我们提供了FDA批准的Patisiran（一种针对转甲状腺素(TTR) mRNA的siRNA）的LNP中脂质的摩尔比例。该配方中脂质的摩尔比为D-Lin-MC3-DMA:DSPC:胆固醇:PEG2000-C-DMG=50:10:38.5:1.5，RNA与脂质的重量比为0.05（wt/wt）。
A. 脂质混合物的制备
1、在乙醇中溶解脂质并制备10 mg/mL的储备液。脂质储备液可以在-20°C下储存以备后用。
注1：带电性脂质通常是液体。由于黏度高，应该使用称重而不是依赖自动移液器的体积。
注2：溶液中的胆固醇应保持温暖（>37℃）以维持流动性。及时转移胆固醇溶液以避免降温。
2、根据以下描述制备脂质混合物溶液。每毫升脂质混合物添加以下内容：548 µL 10mg/mL D-Lin-MC3-DMA（HY-112251），254 µL 10mg/mL 胆固醇（HY-N0322），134 µL 10mg/mL DSPC（HY-W040193），以及64 µL PEG2000-C-DMG（HY-145411）。充分混合溶液以得到清澈的溶液。该混合物含有总计10 mg的脂质。
注3：脂质选择和比例可以根据需要进行更改，这会影响LNP的性质（大小、多分散性和功效）以及所需的mRNA量。
B. siRNA的制备
1、使用100 mM pH 5的乙酸钠缓冲液制备166.7 µg/mL的siRNA溶液。
注4：脂质:siRNA重量比会影响封装效率。可以准备其他重量比的替代配方，并根据需要进行调整。
C. 混合
有三种常用的方法可实现溶液的快速混合：移液器混合法、涡旋混合法和微流控混合法。所有这些混合方法都可用于各种应用。
需要注意的是，移液器混合法和涡旋混合法可能产生较不均匀的LNP，封装效率较低且容易出现变化。微流控装置能够以高度可控和可重复的方式快速混合，得到均匀的LNP和高封装效率。在这些装置中，乙醇脂质混合物和水溶液被迅速组合在单独的流体中，并在两个流体交汇时形成LNP，然后收集到单个收集管中。
1、移液器混合法：
1.1. 移取3 mL的siRNA溶液，并迅速加入1 mL的脂质混合物溶液（通常使用1:3的乙醇脂质混合物与水缓冲液的比例）。快速上下移液20-30秒。
1.2. 将混合后的溶液在室温下孵育至多15分钟。
1.3. 混合后，LNPs用PBS（pH 7.4）透析2小时，使用0.2 μm的过滤器进行无菌过滤，并储存在4°C。
2、涡旋混合法：
1.1. 在涡旋混合器上以适度的速度涡旋3 mL的siRNA溶液。然后，快速加入1 mL的脂质混合物溶液到涡旋的溶液中（通常使用乙醇型脂质混合物与水缓冲液的1:3比例）。继续涡旋混合产生的分散液20-30秒。
1.2. 将混合后的溶液在室温下孵育至多15分钟。
1.3. 混合后，LNPs用PBS（pH 7.4）透析2小时，使用0.2 μm的过滤器进行无菌过滤，并储存在4°C。
3、微流控混合法：
1.1 在微流控设备中，将3 mL的siRNA缓冲溶液和1 mL的脂质混合物溶液以总流速12 mL/min的速率混合（通常使用乙醇型脂质混合物与水缓冲液的1:3比例）。
注 5：流速比和总流速等参数可以进行调整以微调LNPs。
1.2. 混合后，LNPs用PBS（pH 7.4）透析2小时，使用0.2 μm的过滤器进行无菌过滤，并储存在4°C。
体内研究
含有二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC) 的脂质纳米颗粒 (LNP) 和可电离的氨基脂质，例如二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯 (DLin-MC3-DMA) 是有效的体内 siRNA 运载工具。LNP-siRNA 系统经过优化以在小鼠静脉注射后的肝细胞中实现最大基因沉默效力，其中包含摩尔比为 50/10/38.5/1.5 的 DLin-MC3-DMA (MC3)、DSPC、胆固醇和聚乙二醇 (PEG)-脂质。DLin-MC3-DMA 具有优化的 pKa 值，可显著增强效力。